一、引言

Eucrisa^®是輝瑞旗下 Anacor Pharmaceuticals Inc. 擁有的一款專(zhuān)禾刂參考上市藥物（RLD）產(chǎn)品，其軟膏含有2% 的Crisaborole，適用于治療輕度至中度的濕疹（特應性皮炎）。該產(chǎn)品的專(zhuān)禾刂預計于2026年12月14日到期。

Teledyne Hanson 開(kāi)發(fā)并驗證了一種使用 Phoenix RDS（自動(dòng)化擴散測試儀）進(jìn)行 Eucrisa 體外釋放測試（IVRT）的方法。經(jīng)過(guò)驗證的 IVRT 方法可用于支持仿制藥產(chǎn)品與參考上市藥物（RLD）生物等效性（BE）的證明。美國食品和藥物管理局（US FDA）建議采用 IVRT 方法來(lái)評估藥品的一致性，這在 SUPAC-SS 指南中有詳細說(shuō)明^{[1, 2]}。此外，IVRT 也在美國藥典（USP）的通用章節<1724>中被確立為規范程序，該章節描述了測試程序、設備和統計方法，以證明產(chǎn)品的相似性或一致性^[3]。對于某些類(lèi)型的產(chǎn)品，FDA 的法規通常要求仿制產(chǎn)品在定性（Q1）和定量（Q2）上與參考上市藥物相同^[4]。FDA 還提供了物理化學(xué)和結構特性（統稱(chēng)為 Q3）的推薦表征方法，這些方法可以用來(lái)識別擬議中的仿制（測試）局部用藥劑型，并描述可能對其性能至關(guān)重要的藥物產(chǎn)品屬性，以支持在比較兩種局部用藥產(chǎn)品的 Q3 屬性時(shí)證明其生物等效性（BE）^[5]。

近期，人們對將 IVRT 方法作為附加措施來(lái)證明產(chǎn)品相似性產(chǎn)生了極大興趣，這在簡(jiǎn)化新藥申請（ANDA）中尤為突出。美國 FDA 已發(fā)布針對 Crisaborole 2% 的產(chǎn)品特定草稿指南^[6]。歐洲藥品管理局（EMA）也發(fā)布了一份關(guān)于使用 IVRT 程序來(lái)評估產(chǎn)品質(zhì)量和支持局部用藥產(chǎn)品等價(jià)性的指導文件^[7,8,9]。

二、化學(xué)原料及制劑

Crisaborole 認證參考標準品購自 Sigma Aldrich。高效液相色譜（HPLC）級乙腈和乙醇（95%）購自 Cole Parmer。Eucrisa（2% Crisaborole）的參考上市藥物（RLD）從當地藥房購買(mǎi)，批號為 SDAF；有效期至2024年3月。該產(chǎn)品由輝瑞公司分銷(xiāo)。特別在實(shí)驗室生產(chǎn)了含有標簽上標示量的50%、100%和150%的Crisaborole（2%）的局部用產(chǎn)品，用作測試產(chǎn)品，并標識為Crisaborole（2%）。這些產(chǎn)品由一名經(jīng)過(guò)良好培訓的科學(xué)家在印度孟買(mǎi)斯瓦米·維韋卡南達教育協(xié)會(huì )（VES）藥學(xué)院實(shí)驗室內，在一位經(jīng)驗豐富的藥學(xué)教授的監督下制造。本研究工作的部分分析也是在同一設施內進(jìn)行的。

三、反相高效液相色譜（RP-HPLC）

反相高效液相色譜（RP-HPLC）通過(guò)內部驗證的高效液相色譜系統（島津科學(xué)，型號LC-2010）來(lái)測定IVRT樣品中的Crisaborole濃度。該系統配備了光電二極管陣列（PDA）檢測器，并于2023年8月重新校準。整個(gè)研究過(guò)程中使用了Kromasil C18色譜柱（4.6 x 150 mm, 5 µ）。流動(dòng)相由0.05%的四氫呋喃（THF）和水與乙腈按55:45的比例混合而成，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 µL。色譜柱溫度保持在35°C，自動(dòng)進(jìn)樣器在整個(gè)色譜運行過(guò)程中保持在15°C。洗脫液在250 nm波長(cháng)下進(jìn)行監測。

四、IVRT方法的開(kāi)發(fā)

IVRT方法的開(kāi)發(fā)是在Teledyne Hanson的研究實(shí)驗室完成的。該方法通過(guò)評估膜的惰性、Crisaborole在受體介質(zhì)中的溶解度、線(xiàn)性、精密度、重現性、靈敏度、特異性、選擇性及其他參數進(jìn)行了驗證。詳細的方法和驗證數據根據Teledyne Hanson研究的內部政策和程序存儲。

五、Crisaborole的體外釋放測試

該研究按照美國FDA的《半固體制劑放大生產(chǎn)和上市后變更指南》（SUPAC-SS）進(jìn)行。垂直擴散池（VDC）的接收室填充了10 mL的0.5%醋酸溶液，溶劑為水、四氫呋喃和乙醇按55:15:30 V/V的比例混合，并保持在32±1°C；每個(gè)池子上安裝了尼龍膜。大約30分鐘后，細胞達到平衡，然后在膜上施加約400 mg的2% Crisaborole。為了防止蒸發(fā)并保持產(chǎn)品完整性，供體室用玻璃盤(pán)覆蓋。在測試期間，使用設置在400 rpm的磁力攪拌器持續攪拌接收液。

六、釋放速率的計算

釋放速率是使用Higuchi模型計算得出的，該模型假設測試條件完鎂?？紤]到由于替換導致的接收介質(zhì)的明顯稀釋?zhuān)總€(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度都是通過(guò)配備PDA檢測器的RP-HPLC測定的。不同取樣時(shí)間的接收介質(zhì)中Crisaborole的濃度以及累計釋放藥物量是通過(guò)內部驗證的Microsoft Excel電子表格計算得出的。釋放速率對應于繪制的藥物釋放量（μg/cm2）與時(shí)間平方根（√t）的回歸線(xiàn)斜率，并且受樣本體積、細胞體積和細胞孔徑的影響。因此，這些參數在設備資格認證過(guò)程中得到了驗證。

七、統計分析

如美國藥典（USP）通用章節<1724>所述，使用統計方法計算了參考上市藥物（RLD）產(chǎn)品制劑（“已上市"）和每種Crisaborole測試制劑（“內部"）的釋放速率，以計算測試/參考（T/R）比值。使用六個(gè)擴散池對兩種產(chǎn)品進(jìn)行測試，因此共獲得了36個(gè)T/R比值，并按從低到高的順序進(jìn)行排列。按照要求，從列出的T/R比值中確定90%置信區間（CI），其中第8個(gè)和第29個(gè)比值分別是下限和上限。當90% CI在75%–133.33%范圍內時(shí)，認為產(chǎn)品等效。IVRT研究是根據FDA的SUPAC-SS指南^[1]進(jìn)行的。測試產(chǎn)品，即內部Crisaborole（2%）與參考產(chǎn)品Eucrisa（Crisaborole）2%進(jìn)行了比較，如圖1所示。

根據SUPAC-SS指南^[1]，將樣品隨機放置在垂直擴散池上作為測試（T）和參考（R）產(chǎn)品。將R和T的累積藥物釋放量分別繪制成時(shí)間平方根的函數圖。由于常見(jiàn)的測試誤差如氣泡、膜缺陷和非正態(tài)分布的產(chǎn)量測量，使用了非參數統計技術(shù)來(lái)評估測試結果。由于在IVRT期間預計會(huì )出現一些異常值（例如，由于氣泡形成），因此使用了對這類(lèi)異常值存在較為抗性的非參數方法。如USP通用章節1724所建議，使用Mann-Whitney U檢驗來(lái)計算參考和測試產(chǎn)品斜率比的90%置信區間（CI）。

八、比較兩種產(chǎn)品的IVRT

當RLD的Crisaborole 2%軟膏（稱(chēng)為Eucrisa）與一種內部制造的Crisaborole（2%）進(jìn)行比較時(shí)，如表1所示。兩種產(chǎn)品釋放速率的比較表明它們之間存在不一致性（圖1）。在研究結束時(shí)，兩種產(chǎn)品顯示出類(lèi)似的釋放量；最初時(shí)間點(diǎn)數據的差異是導致兩種產(chǎn)品輪廓不匹配的原因。盡管兩種產(chǎn)品都含有2%的Crisaborole，但在輔料類(lèi)型和數量以及Q3因素方面的差異可能影響了研究結果。

表1. Eucrisa參考上市藥物（RLD）與內部產(chǎn)品比較

圖1.Eucrisa參考上市藥物（RLD）與內部產(chǎn)品比較

九、RLD在兩個(gè)不同實(shí)驗室中的比較性體外釋放測試

在兩個(gè)不同的實(shí)驗室中獲取的RLD，即Eucrisa Crisaborole Ointment 2%軟膏的IVRT結果進(jìn)行了對比，并展示在表2中。對兩個(gè)實(shí)驗室數據之間的釋放率進(jìn)行比較表明，如果按照指示的測試方法進(jìn)行，將會(huì )產(chǎn)生相同的結果。釋放率的圖形表示見(jiàn)圖2。

表2. 在兩個(gè)不同實(shí)驗室測試的Eucrisa RLD的IVRT數據

圖2. Eucrisa RLD在兩個(gè)不同實(shí)驗室的IVRT數據

十、結論

根據美國FDA針對Crisaborole的草案指南、SUPAC-SS非無(wú)菌半固體劑型指南以及USP通用章節<1724>的推薦，對自制產(chǎn)品和批準的Crisaborole RLD產(chǎn)品進(jìn)行了體外釋放測試（IVRT）。自制的Crisaborole (2%) 和RLD的IVRT研究結果沒(méi)有達到75%-133.33%的接受標準。通過(guò)比較仿制藥，表明這些在所使用的分析測試方法下，它們的釋放速率并不等同。這種不等同可能是因為仿制制劑與RLD在Q1/Q2上不同；可能主要原因是在它們的配方中使用了不同等級的聚合物。然而，在不同實(shí)驗室獲得的RLD樣品的測試結果相互匹配，并且用50%、100%和150%標示量的2% Crisaborole自制產(chǎn)品的特異性符合方法特異性和靈敏度標準的接受標準。

可以得出結論，IVRT方法非常有助于準確區分釋放速率，這可能反映了產(chǎn)品性能的差異或相似性。此外，結果表明開(kāi)發(fā)的IVRT方法和使用的工具具有檢測配方變化的強大能力。研究中獲得的結果提供了證據，表明Phoenix RDS設備和經(jīng)過(guò)驗證的測試方法有能力準確測定局部用藥產(chǎn)品中Crisaborole的釋放率。這兩者的結合可靠地提供了有說(shuō)服力的數據，這些數據可以用于生物豁免申請中。

十一、參考

1. Nonsterile Semisolid Dosage Forms: Scale-Up and Post approval  Changes (SUPAC-SS): Chemistry, Manufacturing, and Controls;  In Vitro Release Testing and In Vivo Bioequivalence Documentation; Guidance for Industry; U.S. Department of Health and  Human Services, Food and Drug Administration, (CDER).  

2. In Vitro Release Test Studies for Topical Drug Products Submitted  in ANDAs Guidance for Industry. U.S. Department of Health  and Human Services, Food and Drug Administration, CDER,  Oct 2022 

3. <1724> Semisolid Drug Products — Performance test, The United States Pharmacopoeia and National formulary USP 41–NF  36. The United States Pharmacopoeia.  

4. Controlled Correspondence Related to Generic Drug Development Guidance for Industry U.S. Department of Health  and Human Services Food and Drug Administration CDER,  December 2020  

5. Physicochemical and Structural (Q3) Characterization of Topical  Drug Products Submitted in ANDAs Guidance for Industry, U.S.  Department of Health and Human Services Food and Drug  Administration CDER, October 2022 

6. Draft Guidance on Crisaborole: U.S. Department of Health and  Human Services, Food and Drug Administration, CDER, Recommended Feb 2018; revised Feb 2019  

7. Draft guideline on quality and equivalence of topical products,  European Medicines Agency. Committee for Medicinal Products for Human Use. London, UK. October 2018.   

8. Mudyahoto NA, Rath S, Ramanah A, Kanfer I. In Vitro release  resting (IVRT) of topical hydrocortisone acetate creams: A  novel approach using positive and negative controls. Dissolution Technology. 2020 Feb 1;27:6-12. 9. Purazi, P.; Rath, S.; Ramanah, A.; Kanfer, I. Assessment of  “Sameness" and/or Differences between Marketed Creams  Containing Miconazole Nitrate Using a Discriminatory in  vitro Release Testing (IVRT) Method. Sci. Pharm. 2020, 88.